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药学小知识 —— （超）高效液相色谱结构介绍

2022-07-18

1903 年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）和“色谱图”（Chromatogram）的概念。茨维特使用色谱法 chromatography（来自希腊字，chroma 意思是颜色，graphy 意思是记录）来描述他的彩色试验。他在论文中写到：“植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。”
1990 年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有 HPLC 作预分离等。
众所周知，色谱分离的原理就是吸附、解吸、再吸附、再解吸的循环过程。高效液相色谱仪的结构可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。

高压输液泵的功能为驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统。性能要求流量稳定（±1），耐高压（30～60 Mpa），耐各种流动相，例如：有机溶剂、水和缓冲液。种类分为往复泵和隔膜泵。一元、二元、三元泵主要是用来自动配制流动相的。
梯度洗脱装置的作用是让流动相的组成随时间而改变，以调节流动相的极性、离子强度或 pH 值，使试样组分的保留时间得以改变，从而提高分离效率。
色谱柱是用来分离样品中的各个物质。色谱柱是尺寸长 10～30 cm，内径 2～5 mm 内壁抛光的不锈钢管柱。它的填料粒度是 5～10 μm，高效微粒固定相。适应小粒径（约 2 μm）填充剂的耐超髙压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪，则称之为超高效液相色谱仪。
色谱柱类型分为反相色谱柱、正相色谱柱、离子交换色谱柱及手性分离色谱柱。
反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。使用的流动相极性大于固定相的极性。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。使用的流动相极性小于固定相的极性。因此，反相色谱柱和正相色谱柱出峰顺序刚好相反。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。主要用于测定手性化合物。
进样器将待分析样品引入色谱系统。进校系统主要有以下几种，注射器进样装置，由于操作时误差大，现已不再使用；常用的阀进样装置，因体积可变又可固定是较为理想的进样系统；另外还有自动进样器，有利于重复操作并可实现自动化。

检测器用来将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号。紫外吸收检测器是目前 HPLC 应用最广泛的检测器，根据光吸收原理，以适当的光路和电路输出一个与试样浓度成正比的紫外-可见光吸收信号。其他常见的检测器还有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等等。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对流动相加高压。
②高速：分析速度快、流动相流速快，较经典液体色谱法速度要快得多，通常分析一个样品在 15～30 分钟，有些样品甚至在 5 分钟内即可完成，一般小于 1 小时。
③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
④高灵敏度：紫外检测器可精确达 0.01 ng，进样量在 μL 数量级。
⑤应用范围广：70% 以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物分离分析，具有优势。
⑥色谱柱可反复使用：可用一根色谱柱分离不同化合物。
⑦样品用量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
高效液相色谱的缺点是设备单价昂贵、运行成本高，需要使用高纯度的试剂。

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